SEP
SNEST
DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
UNIDAD II
CULTIVO
DE TEJIDOS VEGETALES
QUE
PRESENTA:
YANIXIE PALOMACERVANTES SANTIBAÑEZ
NUMERO DE CONTROL :
09930033
CARRERA:
LIC. BIOLOGÍA
Ciudad
Altamirano, Gro. México. Febrero del 2013
2.1 MEDIOS DE CULTIVO
El cultivo
de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de
planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y
químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o
inducido. Es necesario adoptar procedimientos de asepsia para mantener los
cultivos libres de contaminación microbiana.
Existen distintos tipos de
medios, Sin embargo, existen medios mas frecuentemente utilizados como son:
1.-El medio murashige
2.- Skoog (MS)
3.-White,
4.- Gamborg et al (B5).
5.- El medio Knudson para
orquídeas etc.
Algunos medios resultan bastante sencillos como el
Knudson, el cual contiene sólo 4 componentes y no incluye microelementos ya que se supone que se encuentran como
impurezas en los otros componentes.
En cultivos de frutales y
hortalizas el medio más utilizado es MS (publicado en 1962 y considerado uno de
los mayores aportes al cultivo de tejidos)
2.1.1
AREAS DEL LABORATORIO DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Dentro de un laboratorio de cultivo de tejidos, se encuentran varias
áreas de trabajo divididas esquemáticamente para desarrollar las diferentes
funciones, prácticas o trabajos.
Las áreas o secciones principales
son:
2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
Suponiendo
que se establecerá un laboratorio de cultivo de tejidos de tamaño medio, se
requieren, para ponerlo en funcionamiento, las siguientes piezas de equipo
estándar:
2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo se puede determinar, como
solución o formulación químicamente definida, donde un explante encuentra las
condiciones adecuadas para desarrollar su potencial intrínseco. Las células vegetales requieren gran variedad de nutrimientos orgánicos
e inorgánicos, para desarrollarse, ambos nutrimentos se requieren en dos
niveles: uno macro y otro micro. El primer objetivo en la preparación de un
medio de cultivo es suministrar los nutrimentos minerales en concentraciones
adecuadas. Se debe incluir macro elementos ( C, H, O, P, K, N, S, Ca Y Mg ) y
los microelementos ( B, Zn, Mn, Cu, Mo, Fe, Cl ).
Los medios de cultivo
constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in vitro” de células,
tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones y
lograr la micropropagación, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de
componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en
dependencia del objetivo que se persiga en su utilización. Así, los medios de
cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen sustancias
minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc.
COMPUESTOS ORGÁNICOS
COMPUESTOS INORGÁNICOS
2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO
El medio de
cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales
puedan desarrollarse con normalidad, entre sus componentes encontramos:
SALES INORGÁNICAS
Macro-nutrientes
Los
elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.
Micro-nutrientes
Estos micro-nutrientes
son importantes en las células vegetales, ya que al adicionarles ciertas
cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales madres sean mas eficaz
para el medio de cultivo
FUENTES DE CARBONO
Normalmente
para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar
una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene
lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad.
La sacarosa
es la más utilizada para propósitos de Micropropagacion.
Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa. El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagación en muchos casos.
Los azucares
en el medio cumplen dos funciones esenciales:
1.-Son
fuentes de energía.
2.-Mantienen
en el medio un potencial osmótico determinado.
VITAMINAS
La mayor
parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero
aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen
crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.
La tiamina
(B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras
vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in
vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico
(B5).
AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son usados como
constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por
adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona,
triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina,
etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina,
L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina,
L-serina y L-cisteina.
Nitsch y Nitsch (1957) señalan que las formas L de
los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D
ya que estas son tóxicas.
REGULADORES DE CRECIMIENTO
Adicionalmente
a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más sustancias
reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces también
Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro
de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias
varían considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de
estos reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.
El uso de
fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se
ha demostrado que la clase y concentración de dichas sustancias interactúan con
el genoma de la planta. (Montoya, 1991)
Auxinas
Son
utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de
callo. Las más utilizadas son:
IBA: (ácido
indol-3-butírico) = diferenciación de raíces
ANA: (ácido
naftalenacético) = diferenciación de raíces
IAA: (ácido
indolacético) = Prolongación de explantes
2,4-D:
(ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.
Citoquininas
Promueve la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y órganos. Brotación.
— Las
Citoquininas más usadas son:
— BAP:
(bencilamino purina)
— Kinetina
— 2-ip
(isopentenil-adenina).
(Generalmente
son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio).
Giberelinas
Su función
principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con
mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor
(pierde el 90% de su actividad después del autoclavado)
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.
· Acido abscísico
El ácido
abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en
los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de
embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de
la división celular.
AGAR
El agar es un gel que se extrae de
algas marinas y que por sus características físicas se emplea para solidificar
el medio básico, cuando se trabaja con cultivo estacionario sólido o
semi-sólido.
AGUA
Es el elementos indispensable ya que se utiliza para aforar al volumen que se requiera.
2.1.5 PREPARACIÓN Y MANEJO DE
SOLUCIONES STOCK
Se denomina solución madre o
stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales están formuladas
por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado número de compuestos que incluye
y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentración, resulta más
práctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace
más rápida la futura preparación de medios y minimiza los errores, ya que La composición de
una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por lo tanto es
indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o
masa de disolvente, es decir su concentración.
Componentes de soluciones
madres o stock que en conjunto con otros elemento (sacarosa, phytagel y
hormonas de crecimiento) conforman un medio de cultivo MS)
DILUCIÓN DE SOLUCIONES Y SOLUCIÓN STOCK
Para diluir una solución es preciso agregar más
% de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la
dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian,
aunque el soluto no.
Entonces por una solución stock se entenderá como
aquella solución concentrada de nutrientes o de fitohormonas.
2.1.6 PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Es necesario preparar el medio de cultivo
utilizando agua bidestilada o agua desmineralizada-destilada. Se debe evitar el
almacenamiento prolongado del medio para evitar la acumulación de
contaminantes; todas las sustancias utilizadas para su preparación deben ser de
un alto grado de pureza.
a)Medios semisólidos sin
sustancias termolábiles; su preparación consta:
1.- Preparación del medio basal
(MB) de los reguladores de crecimiento o de otros compuestos. Ajuste de pH
2.-Adición y solución del Agar
3.-esterilización en autoclave
b) Medios líquidos con sustancias termolábiles.
Para su preparación se sigue el mismo del inciso a, pero sin adicionar agar, y
haciendo la esterilización por filtración, en el caso de medios que contengan
sustancias termolábiles.
c) Medios semisólidos con una o más sustancias
termolábiles; para su preparación se siguieren las siguientes operaciones:
*Incorporación de los compuestos que pueden ser esterilizados en
autoclave (tanto los del MB como los reguladores de crecimiento u otros
compuestos). Ajuste del pH.
*Adición y disolución del agar.
*Esterilización en el autoclave
*Incorporación (operando en la cámara de
transferencia) de las sustancias termolábiles, previamente esterilizadas por
filtración. Los compuestos esterilizados se deben mantener a una temperatura
entre 40 y 50 0C.
*Distribución
(operando en la cámara de transferencia) del medio en los recipientes de
cultivo (tubos de ensayo, cajas de Petri, etc.) previamente esterilizados en
autoclave.
Medio MS: Es un preparado comercial que contiene las distintas
sales mezcladas y listas para ser disueltas en medio líquido. Cuando se
disuelven en la cantidad adecuada, la concentración final de los distintos
nutrientes minerales es la mostrada en la Tabla.
Dicho medio básico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las
vitaminas están preparadas en
disoluciones concentradas stock, que, al ser termolábiles, se esterilizan por
filtración:
· Vitaminas (termolábiles, STOCK 1000 v.c.):
1. Ácido nicotínico 5 mg·L-1
2. Tiamina hidrocloruro 5 mg·L-1
3. Piridoxina hidrocloruro 1 mg·L-1
· Mio-inositol 1 g·L-1
· Sacarosa 3 %
· Para medio sólido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 %
2.2
ESTERILIZACION
Son todos
aquellos métodos físico-químicos que sirven para eliminar los microorganismos y
las esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivo.
Desinfección:Consiste en remover los
microorganismos del material inerte como bisturí, cajas de Petri, asas
bacteriológicas entre otros.
Desinfestación:Consiste en remover
superficialmente los microorganismos con métodos suaves.
2.2.1 TIPOS DE
ESTERILIZACION
CALOR SECO:
Los recipiente de vidrio
secos que se utilizan para operaciones estériles, se pueden esterilizar por
medio de aire caliente; para el efecto se colocan en una estufa de aire
caliente a una temperatura mínima de 170 oC, preferiblemente durante dos horas,
pero nunca menos de un hora. El algodón (debidamente envasado) a menudo se
esteriliza por intervalos más largos, ya que tiende a contener esporas
altamente resistentes; puesto que tanto el algodón como el papel toman un color
marrón a temperatura de 190 oC o superiores, para estos materiales se debe usar
una temperatura menor de 170 oC, manteniéndolo bajo ella por lo menos durante
una hora.
VAPOR BAJO PRESIÓN (AUTOCLAVE)
El vapor bajo presión es muy
eficiente para destruir todas las formas de bacterias y hongos y sus esporas, y
es el método más utilizado para esterilizar diferentes materiales incluyendo
los medios de cultivo (siempre y cuando no contengan componentes termolábiles).
El autoclave más utilizado
actualmente en el laboratorio es la contraparte de mayor tamaño de la olla de
presión común. Al utilizarlo, es necesario extraer todo aire antes de empezar
el proceso de esterilización ya que, a presión iguales, la temperatura de una
mezcla de aire y vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extracción del
aire se logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire del
aparato, antes de cerrar la válvula correspondiente.
CALOR HUMADO A
100OC
Con este método
probablemente sea suficiente una sola exposición de 15 minutos al calor vivo
(100oC) para matar todas las formas vegetativas microbianas. Sin embargo, así
no se matan necesariamente todas las formas de espora y puede ser práctico, por
consiguiente, efectuar la esterilización intermitente, siempre y cuando se
disponga de cierto equipo.
En este caso, la exposición
puede ser de 30 a 60 minutos y se repite diariamente durante tres días
consecutivos, conservando el material a la temperatura del cuarto o en una
incubadora entre una exposición y otra.
Filtración:
La esterilización de medios
va acompañada rutinariamente de la filtración a través de filtros especiales a
prueba de hongos y bacterias. Es claro que los filtros y otros aparados se
deben esterilizar antes de tratar de utilizarlo para remover los contaminantes
de un líquido.
Obviamente el tamaño del
poro es el principal factor en la capacidad de retención de bacterias de estos
filtros; otros factores que afectan la penetrabilidad del filtro por los
microorganismos son el pH, la carga eléctrica del material filtrado, la
temperatura, la presión y la duración del procedimiento de filtración, así como
el efecto de la absorción de proteínas y otras sustancias.
2.2.2 FACTORES
QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACION
FISICOS
QUIMICOS
2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE
TEJIDOS
El cultivo de tejidos en su acepción amplia puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos células desprovistas de pared celular (células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisión de esta definición puede generar muchas polémicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es común dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisólidos y b) cultivos en medios líquidos, los que a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. También es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubación.
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
2.3.2
SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES
La selección de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que van a obtener son idénticas al progenitor (propagación asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sería deseable conocer el virus específico presente, pues así las condiciones de cultivo varían, aplicándose termoterapia o simplemente cultivo de meristemos.
El tamaño del inóculo también es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de diámetro, y ápices de tallo que miden de 0.1 a 0.3 mm de diámetro; generalmente el número de plántulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamaño del meristemo o ápice cultivado.
Por último, es importante señalar que el medio de cultivo es un factor esencial, ya que en él juegan un papel vital los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales, específicos de la especie que estemos cultivando; éstos deben de ser semejantes a los que se tienen en condiciones naturales.
2.3.3 EXPLANTE
Tejido removido de un organismo y transferido para su crecimiento a un medio artificial de nutrientes
La elección de un Explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, dicha elección en parte está determinada por el objetivo a estudiar y la especie vegetal involucrada.
El tamaño del Explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el establecimiento de los cultivos; cuanto más grande sea, mayores son las posibilidades de obtener proliferación callosa; existe un tamaño mínimo para la proliferación, el efecto del tamaño del Explante puede apreciarse en cualquier sistema de cultivo e independientemente de la fuente de donde proviene; su importancia ha sido señalada en cultivos de meristemos, anteras, suspensiones celulares, embriones y protoplastos.
2.3.4 SIEMBRA
DEL EXPLANTE
2.3.4 SIEMBRA
DEL EXPLANTE
En este proceso se toma un frasco con medio de cultivo se quita el sello,
posteriormente se toma con una pinza (previamente esterilizada) el explante y
se coloca dentro del medio de cultivo, esto cuidando que la yema quede hacia
arriba,tomanado en cuenta la polaridad de la planta madre; ya que puede llegar
a suceder una polaridad invertida la cual va a depender de los ápices, raíces,
hojas, semillas, tallos y yemas, en que se siembre la planta así. Tambien es
importante hacer esto cerca del fuego y no introducir la mano dentro del frasco
con el medio de cultivo, es también de mucha importancia no colocar la tapa
boca abajo ni tocar la parte interior de la misma. Una vez sembrado el explante
se cierra fuertemente el frasco y de esterilizan de nuevo las pinzas para
realizar el mismo procedimiento al sembrar el siguiente explante.
2.6 CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE
2.3.5
CONDICIONES DE INCUBACION
Son
muchas las condiciones y factores que afectan la capacidad de supervivencia de
los explantes, su establecimiento, su habilidad para reproducirse, de
regeneración son varias algunas de las que se deben de tomar en cuenta son las
siguientes:
ASEPSIA: Esta asepsia esta referida tanto al material vegetal, a
los medios recipientes de cultivo, cuartos de cultivo, lugares de transferencia
de cultivos, como a los operario y herramientas con los cuales se lleva a cabo
la manipulación de los cultivos. Esto para
evitar cualquier contaminación en el cultivo de tejidos vegetales
GENOTIPO: Algunos tipos de plantas parecen ser más aptas y
presentar mayores respuestas en el cultivo in vitro; existen diferencias en la regeneración
de plantas que son dependientes de cada genotipo
EFECTOS DE POSICION Y COMPETENCIA: Existen fuertes diferencias
entre célula y célula y entre distintos tipo de órganos en cuanto a capacidad
de regeneración en cultivo de tejidos. Se considera en general que los tejidos
embriogenéticos, meristemáticos y reproductivos parecen tener una mayor propensión
para el crecimiento y morfogénesis en cultivo de tejidos
EXPLANTE: Se debe tener en cuenta el tamaño, fuente, edad,
fidiología, en cuanto al tamaño este no debe ser pequeño ya que es menor su
capacidad de supervivencia
2.6 CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE
Los cambios fisiológicos dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales, algunos de los cambios que sufren las plantas al ser sometidas a diferentes condición son:
2.3.7. TRASPLANTE AL SUSTRATO
El transplante se debe realizar mediante aclimatación ( endurecimiento)
Como se debe aclimatar?
· La planta se aclimata de 4-8 semanas
· Debe ser paulatina y secuencialmente
· Se controla la luz desde el 20% hasta el 100% por medio de mayas
· Sustrato en las dos primeras semanas se riega con m.s. al 25% diluido
· H.R. se mantiene desde aproximadamenteel 100% a normal. (usando riego nebulizado)
· Normalmente se cortan las raíces de las plantas in vitro antes de transplantarlas, agregándole un enraizado.
Cabe mencionar que el trasplante de una plántula in vitro a campo debe ser aclimatada, cuyo proceso regularmente dura entre 4 y 8 semanas, esto consiste en el endurecimiento y adaptación de la plántula al campo, lo cual debe ser de forma paulatina y secuencial.
1. Se controla la luz desde iniciando desde un 20% hasta llegar al 100%.
2. El sustrato de la plántula es regado con medio MS diluido, a una concentración al 25% en agua de riego durante las dos primeras semanas, en la etapa de adaptación a campo.
3. La humedad relativa se mantiene alta, a un 100% de forma natural, o bien haciendo uso de un sistema de riego con nebulizadores.
4. Normalmente las raíces de las plantas a trasplantar a campo le son cortadas las raíces para sembrarlas sin ellas, solo se le agrega enraizador en la parte inferior del tallo y listo.
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